L’aumento della mortalità nei casi di COVID-19 è spesso associato a complicazioni microvascolari. Abbiamo recentemente dimostrato che la proteina spike del coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) promuove una risposta di segnalazione trans indotta dalla citochina infiammatoria interleuchina 6 (IL-6)/IL-6R e la secrezione di alarmin. Le cellule epiteliali umane infettate dal virus o trapiantate con spike hanno mostrato un aumento della senescenza, con un rilascio di molecole infiammatorie legate al fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP). L’introduzione dell’inibitore AZD5153 della bromodomain-containing protein 4 (BRD4) nelle cellule epiteliali senescenti ha invertito questo effetto e ha ridotto il rilascio di molecole infiammatorie legate alla SASP in TMNK-1 o EAhy926 (linee cellulari endoteliali umane rappresentative), quando le cellule sono state esposte al mezzo di coltura cellulare (CM) derivato da cellule A549 che esprimono la proteina spike SARS-CoV-2. Le cellule hanno anche mostrato un fenotipo di senescenza con una maggiore espressione di p16, p21 e β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal) e hanno innescato le vie SASP. L’inibizione di IL-6 trans segnalazione da tocilizumab e l’inibizione della segnalazione del recettore infiammatorio dal Bruton tirosina chinasi (BTK) inibitore zanubrutinib, prima dell’esposizione del CM alle cellule endoteliali, inibito p21 e p16 induzione. Abbiamo anche osservato un aumento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle cellule A549 trapiantate con spike e nelle cellule endoteliali esposte alla CM trapiantata con spike. La generazione di ROS nelle linee cellulari endoteliali è stata ridotta dopo il trattamento con tocilizumab e zanubrutinib. La senescenza cellulare è stata associata a un aumento del livello delle molecole di adesione endoteliale molecola di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM-1) e molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1), che hanno un potenziale di attacco leucocitario in vitro. L’inibizione della senescenza o della funzione SASP ha impedito l’espressione di VCAM-1/ICAM-1 e l’attacco dei leucociti. Nel complesso, abbiamo identificato che le cellule endoteliali umane esposte al surnatante di coltura cellulare derivato dall’espressione della proteina spike SARS-CoV-2 hanno mostrato i marcatori di senescenza cellulare, portando ad una maggiore adesione dei leucociti.

IMPORTANTE Il presente studio aveva lo scopo di esaminare il meccanismo alla base delle manifestazioni extrapolmonari della patogenesi associata alla proteina spike SARS-CoV-2, con l’idea che l’infezione dell’epitelio polmonare può portare a mediatori che guidano la disfunzione endoteliale. Abbiamo utilizzato l’espressione della proteina spike SARS-CoV-2 in epatociti umani coltivati (Huh7.5) e pneumociti (A549) per generare un mezzo di coltura condizionato (CM). Le linee cellulari endoteliali (TMNK-1 o EAhy926) trattate con CM hanno mostrato un aumento dei marcatori di senescenza cellulare in modo paracrino e hanno portato all’adesione dei leucociti. Nel complesso, è implicato il legame tra queste risposte nella senescenza delle cellule endoteliali e un potenziale contributo alla complicazione microvascolare negli esseri umani infettati dalla SARS-CoV-2 in modo produttivo. Inoltre, l’uso di inibitori (BTK, IL-6 e BRD4) ha mostrato un effetto inverso nelle cellule senescenti. Questi risultati possono supportare la selezione di potenziali modalità terapeutiche aggiuntive per impedire la patogenesi associata alla SARS-CoV-2.

INTRODUZIONE Il coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) è il settimo coronavirus noto per infettare l’uomo. Tra questi coronavirus, il coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV), il coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) e il SARS-CoV-2 possono causare gravi malattie (1). SARS-CoV e MERS-CoV inducono un sostanziale effetto citopatico e una disregolazione delle risposte immunitarie dell’ospite. La patogenesi immunomediata è probabilmente un potenziale fattore di esito grave nei pazienti infettati da MERS-CoV. L’infezione dei fagociti mononucleati (MNP) è abortiva nella SARS-CoV; tuttavia, MERS-CoV può replicarsi nei monociti, nei macrofagi e nelle cellule dendritiche (2). L’evidenza di un’infezione produttiva di SARS-CoV-2 nelle cellule immunitarie deve ancora essere determinata. I potenziali meccanismi di progressione della malattia includono alti tassi di replicazione virale, che potrebbero essere responsabili di una maggiore citolisi delle cellule ospiti, e la forte produzione di citochine e chemochine infiammatorie da parte delle cellule epiteliali infette (3), che perpetua il danno virtuale e l’accumulo eccessivo di monociti, macrofagi e neutrofili. La gravità della malattia è correlata alle citochine infiammatorie presenti nel siero. Il ruolo delle eccessive risposte infiammatorie indotte dalla SARS-CoV-2 come fattore che contribuisce alla gravità della malattia deve essere esaminato criticamente. Il danno renale acuto (AKI), il danno cardiaco e il dolore addominale sono le comorbidità più comunemente riportate nella COVID-19 (4, 5). L’infezione da SARS-CoV-2 può essere associata a danni dovuti a specifiche condizioni patogene, compresa la sindrome da rilascio di citochine (6).

La senescenza cellulare è innescata da insulti stressanti e da alcuni processi fisiologici, caratterizzata da un arresto del ciclo cellulare prolungato e generalmente irreversibile con caratteristiche secretorie, danni macromolecolari e metabolismo alterato (7). Le cellule primarie normalmente raggiungono la senescenza replicativa dopo un numero limitato di raddoppi di popolazione (8). Le cellule senescenti secernono un eccesso di fattori solubili, tra cui citochine e chemochine proinfiammatorie, modulatori della crescita, fattori angiogenici e metalloproteinasi di matrice (MMP), che sono collettivamente definiti il fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) (9, 10). La funzione SASP costituisce un segno distintivo delle cellule senescenti e media molti dei loro effetti fisiopatologici.

Il presente studio affronta gli effetti associati alle cellule epiteliali che esprimono la proteina spike SARS-CoV-2 e la risposta paracrino-associata generata nelle cellule endoteliali che porta alla senescenza. I risultati di questo studio hanno identificato un meccanismo attraverso il quale l’infezione da SARS-CoV-2 propaga l’effetto paracrino, suggerendo potenziali mezzi terapeutici per interdire i passi meccanici rilevanti che impediscono la funzione deleteria della SASP.

RISULTATI L’espressione della proteina spike SARS-CoV-2 nelle cellule A549 induce marcatori di senescenza.
La senescenza cellulare può avere un ruolo negli scarsi risultati clinici dei pazienti COVID-19 (11). Abbiamo esaminato se le cellule A549 trasfettate con il plasmide full-length spike mostrano l’espressione dei marcatori di senescenza. L’esame mediante immunofluorescenza delle cellule A549 trasfettate con il plasmide spike che mostrano l’espressione della proteina spike ha mostrato una maggiore espressione del marcatore di senescenza β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal). D’altra parte, un’espressione simile o ridotta di SA-β-Gal è stata osservata nell’apparente assenza di espressione della proteina spike nelle cellule, che può essere dovuta a un effetto paracrino dalle cellule vicine che esprimono spike. L’aumento dell’espressione è stato visto in modo più evidente nelle singole cellule, con una minore fluorescenza visibile nelle cellule circostanti (Fig. 1A). Le cellule A549 hanno mostrato un livello estremamente basso di infezione con SARS-CoV-2. Tuttavia, i lisati delle cellule infettate dal virus mostravano un’espressione di p21 e p16 chiaramente migliorata. Allo stesso modo, le cellule A549 che esprimono la proteina spike hanno anche mostrato un aumento dei marcatori p21 e p16 (Fig. 1B). In modo simile, le cellule Huh7.5 infettate dal virus o trapiantate con spike hanno anche mostrato livelli elevati di p21 e p16 (Fig. 1C).
FIG 1

FIG 1 L’espressione della proteina spike SARS-CoV-2 induce i marcatori di senescenza nelle cellule. Le cellule A549 trapiantate con spike hanno mostrato un arrotondamento e una maggiore espressione della β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal) in presenza della proteina spike SARS-CoV-2 (A). Le cellule A549 (B) o Huh7.5 (C) infettate dal virus o che esprimono la proteina spike hanno anche mostrato l’induzione dei marcatori di senescenza p21 e p16, così come l’espressione della proteina spike SARS-CoV-2. Il livello di espressione dell’actina in ogni corsia dello stesso gel è mostrato come carico proteico totale per il confronto. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.

Lo stress ossidativo è associato alla patologia dell’infezione da SARS-CoV-2, compresa la sua amplificazione delle citochine (12), e le specie reattive dell’ossigeno (ROS) giocano un ruolo significativo nello stress ossidativo. Le cellule senescenti sono caratterizzate da un aumento dei livelli di ROS. La generazione di ROS è associata all’induzione della senescenza e al mantenimento di uno stato senescente vitale nelle cellule A549 (13, 14). Qui, abbiamo misurato i ROS intracellulari e abbiamo osservato un aumento di circa 3 volte dei ROS nelle cellule A549 trasfettate con spike rispetto ai livelli nelle cellule di controllo trasfettate con plasmide vuoto (Fig. 2A). L’aumento della produzione di ROS intracellulare contribuisce al danno al DNA, portando alla senescenza cellulare. Abbiamo osservato un aumento del marcatore di risposta al danno al DNA γ-H2AX nelle cellule trasfettate con il gene virale spike (Fig. 2B). Il γ-H2AX è stato trovato localizzato nel nucleo delle cellule A549 trasfettate con il gene spike virale (Fig. 2C). I nostri risultati indicano che l’espressione della proteina spike SARS-CoV-2 induce uno stato di senescenza nelle cellule A549 trapiantate con spike, che è associato alla risposta al danno al DNA e all’aumento della generazione di ROS.
FIG 2

FIG 2 L’espressione della proteina SARS-CoV-2 spike genera stress ossidativo nelle cellule A549. La trasfezione di SARS-CoV-2 spike induce il rilascio di specie reattive dell’ossigeno (ROS) (A), l’espressione di γ-H2AX (B) e la localizzazione nucleare di γ-H2AX (C). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i risultati sono presentati come media ± deviazione standard. **, P < 0.005. DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenilindolo.

Bromodomain-containing protein 4 inibitore reprime il fenotipo secretorio associato alla senescenza.
Bromodomain-containing protein 4 (BRD4) è un nuovo regolatore del meccanismo di senescenza. L’espressione BRD4 è richiesta nella sorveglianza immunitaria della senescenza e nella segnalazione associata alla SASP (15). La trasfezione del gene Spike sulle cellule A549 ha portato ad una maggiore espressione di BRD4 (Fig. 3A). Le cellule A549 sono state trasfettate con la proteina spike SARS-CoV-2 e incubate per 48 ore prima dell’esposizione per 16 ore all’inibitore BRD4 AZD5153. L’espressione della proteina spike ha indotto i marcatori di senescenza p21 e p16, i cui livelli sono stati ridotti dall’aggiunta di AZD5153 (Fig. 3B). Le cellule A549 trasfettate da Spike hanno esibito una maggiore secrezione di molecole infiammatorie legate a SASP come l’alarmina HMGB1 e le citochine interleuchina 1α (IL-1α) e IL-6. Il trattamento con l’inibitore BRD4 AZD5153 nelle cellule A549 trapiantate con spike (come descritto sopra) ha ridotto i livelli di secrezione di queste molecole infiammatorie (Fig. 3C). I nostri risultati suggeriscono che la presenza della proteina spike SARS-CoV-2 nelle cellule A549 induce il rilascio di molecole infiammatorie legate alla SASP che potrebbero essere impedite utilizzando un inibitore di BRD4.
FIG 3

FIG 3 Le cellule A549 trasfezionate con SARS-CoV-2 spike mostrano l’induzione di BRD4, marcatori di senescenza e un maggiore rilascio di HMGB1 e citochine. La trasfezione di spike ha aumentato l’espressione di BRD4 (A) e ha indotto l’espressione di p21 e p16, che sono state inibite dall’aggiunta dell’inibitore AZD5153 (B). L’espressione della proteina SARS-CoV-2 spike è mostrata anche nei pannelli corrispondenti. Le cellule trasfettate hanno mostrato una maggiore secrezione di HMGB1, IL-1α e IL-6 (C). L’espressione delle citochine è stata inibita da AZD5153. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard. *, P < 0,05; **, P < 0,005.

Il mezzo di coltura condizionato da cellule epiteliali trasfettate da spike induce una modalità paracrina di senescenza nelle cellule endoteliali.
Le cellule senescenti secernono molecole infiammatorie che possono indurre la senescenza paracrina nelle loro cellule circostanti. Abbiamo esaminato se le cellule epiteliali senescenti generate dalla trasfezione del picco stimolano la senescenza paracrina nelle cellule endoteliali vicine dove l’espressione della proteina del picco SARS-CoV-2 è assente. Per questo, abbiamo incubato le cellule endoteliali TMNK-1 con il mezzo di coltura condizionato (CM) raccolto dalle cellule A549 che esprimono la proteina spike SARS-CoV-2. Abbiamo osservato una fluorescenza verde associata all’espressione di SA-β-Gal nelle cellule trattate con spike CM (Fig. 4A). Abbiamo anche osservato una forte espressione dei marcatori di senescenza p21 e p16 dalle cellule TMNK-1 trattate con spike CM. Tuttavia, l’incubazione con CM da cellule A549 che esprimono spike, precedentemente trattate con l’inibitore BRD AZD5153, ha portato ad una perdita di miglioramento sia di p21 che di p16 nelle cellule TMNK-1 (Fig. 4B). Abbiamo precedentemente osservato che il picco SARS-CoV-2 induce la senescenza nelle cellule Huh7.5. Per verificare se le molecole infiammatorie SASP rimaste nel CM inducono un effetto paracrino sulle cellule endoteliali, abbiamo eseguito un test SA-β-Gal in cellule TMNK-1 incubate con CM da cellule Huh7.5 che esprimono spike. Un risultato simile è stato notato con l’espressione SA-β-Gal dalle cellule TMNK-1 dopo l’incubazione con il CM raccolto dalle cellule Huh7.5 che esprimono spike SARS-CoV-2 trattate con AZD5153 (Fig. 4C). Il rilascio di molecole SASP è una firma del meccanismo di senescenza. Un aumento dei livelli di rilascio SASP legati molecole infiammatorie HMGB1, IL-1α, IL-6, e monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) è stato osservato anche in spike CM-trattato cellule TMNK-1 (Fig. 4D). Quindi, i nostri risultati hanno indicato un’induzione della senescenza paracrina delle cellule endoteliali come effetto secondario delle cellule epiteliali che esprimono la SARS-CoV-2.
FIG 4

FIG 4 Marcatori di senescenza in TMNK-1 dopo l’incubazione con CM da cellule epiteliali che esprimono la proteina spike SARS-CoV-2. Il CM da cellule A549 trasfettate con spike ha indotto l’espressione di SA-β-Gal, mostrata dall’immunofluorescenza (A), e l’espressione della proteina p21/p16, mostrata dal Western blot (B). Il CM da cellule Huh7.5 trasfettate con spike ha anche indotto l’espressione SA-β-Gal, mostrata dall’immunofluorescenza (C). L’uso di inibitore AZD5153 inibito senescenza marcatore espressione da entrambi A549 (B) e Huh-7.5 (C) spike-trasfettati CM. Il rilascio di SASP-molecole infiammatorie correlate, vale a dire, HMGB1, IL-1α, IL-6, e MCP-1, da spike-espressione A549 CM è stato misurato da enzima limitato immunosorbente (ELISA) (D). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i risultati sono presentati come media ± deviazione standard. **, P < 0.005.

L’inibizione della segnalazione mediata dal recettore infiammatorio inverte la modalità paracrina della senescenza delle cellule endoteliali.
Abbiamo dimostrato qui che l’esposizione del CM delle cellule epiteliali che esprimono SARS-CoV-2 spike stimola la senescenza paracrina delle cellule endoteliali a causa della presenza di livelli più elevati di molecole infiammatorie legate al SASP. Si prevede che le molecole infiammatorie presenti nella CM delle cellule che esprimono spike, come HMGB1, IL-1α e IL-6, possano legarsi a diversi recettori sulla superficie delle cellule endoteliali e stimolare la segnalazione mediata dai recettori Toll-like (TLR). La stimolazione della segnalazione TLR porta all’attivazione delle molecole a valle Akt e p38-MAPK, e queste molecole attive sono regolatori cruciali del fenomeno della senescenza. Abbiamo osservato che l’esposizione di TMNK-1 e EAhy926 linee cellulari simili a quelle endoteliali a spike CM ha portato ad un aumento della fosforilazione delle molecole Akt e p38-MAPK (Fig. 5A e B). L’inibitore della tirosin-chinasi di Bruton (BTK) zanubrutinib è usato per trattare i tumori maligni delle cellule B e impedisce una vasta gamma di segnalazione del recettore infiammatorio, compreso quello del recettore del fattore di necrosi tumorale (TNFR), IRAK, e tutti i TLR tranne TLR3 (16). Il trattamento delle cellule endoteliali TMNK-1 e EAhy926 con zanubrutinib prima dell’esposizione a spike CM ha causato una significativa attenuazione della fosforilazione di Akt e p38-MAPK (Fig. 5A e B).
FIG 5

FIG 5 Modulazione dell’attivazione di Akt e p38 nelle cellule endoteliali e induzione dei marcatori di senescenza cellulare da parte del CM da cellule A549 che esprimono spike virali come risposta paracrina. TMNK-1 o EAhy926 cellule sono state esposte a A549 spike CM per 24 h e misurato mediante analisi Western blot per la fosforilazione di Akt, p38-MAPK (A e B), p21, e p16 (C e D). All’esposizione, i singoli pozzetti sono stati trattati con zanubrutinib o tocilizumab, come indicato.

Il nostro studio precedente ha rivelato che l’esposizione di CM da cellule epiteliali che esprimono SARS-CoV-2 spike innesca l’attivazione di STAT3 nelle cellule endoteliali TMNK-1, che viene bloccata dal trattamento con tocilizumab (un anticorpo monoclonale che inibisce la segnalazione IL-6) (17). STAT3 è anche uno dei regolatori chiave del meccanismo di senescenza. Poiché le CM A549 che esprimono spike contenevano molecole infiammatorie HMGB1-, IL-1α-, e IL-6-like, abbiamo esaminato se l’introduzione di tocilizumab e zanubrutinib può prevenire la senescenza paracrina generata in questo modo. Abbiamo osservato che l’espressione elevata di marcatori di senescenza p21 e p16 è stata ostacolata individualmente dal trattamento con tocilizumab o zanubrutinib nelle cellule TMNK-1 e EAhy926 incubate con spike CM (Fig. 5C e D). Questi risultati hanno ulteriormente verificato che la senescenza delle cellule endoteliali si verifica a causa di un effetto paracrino legato alla senescenza dello spike SARS-CoV-2 stabilito nella linea cellulare di pneumociti trasfettati A549.
Il mezzo di coltura A549 trasfettato da spike induce la generazione di specie reattive dell’ossigeno nelle cellule endoteliali.
Livelli elevati di ROS sono comunemente osservati nelle cellule senescenti (13). È stato dimostrato che i ROS intracellulari ed extracellulari contribuiscono all’induzione della senescenza. Qui, abbiamo esaminato la produzione di ROS nelle cellule endoteliali esposte a CM da cellule A549 che esprimono spike in presenza di inibitori specifici. I livelli di ROS sono stati aumentati di circa 2 volte nelle cellule endoteliali (TMNK-1 e EAhy926) esposte al CM delle cellule A549 che esprimono spike, rispetto a quelle esposte al mezzo di controllo. L’uso di tocilizumab e zanubrutinib ha inibito la produzione di ROS nelle cellule endoteliali coltivate in presenza di A549 spike CM (Fig. 6A e B).
FIG 6

FIG 6 Il mezzo di coltura A549 spike-trasfettato induce la generazione di ROS nelle cellule endoteliali. La produzione di ROS in due cellule endoteliali (A e B) esposte al CM A549 spike è stata misurata in presenza o assenza di inibitori. CM ha diminuito la capacità proliferativa delle cellule endoteliali, come mostrato da MTT progressivamente ridotto [3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro] attività rispetto a quella di controllo CM. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. I livelli di ROS sono stati aumentati di circa 2 volte nelle cellule sperimentali rispetto a quelli delle cellule di controllo trattate con mock. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. La percentuale di adesione è stata determinata da un rilascio di fluorescenza da monociti umani (THP-1) dopo 6 ore di adesione su TMNK-1 trattati (C) e EAhy926 (D) cellule. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard. *, P < 0.05.

L’esposizione delle cellule endoteliali a A549 spike-transfected mezzo di coltura mostra diminuita proliferazione.
La senescenza è un arresto irreversibile della proliferazione cellulare mentre la cellula mantiene la funzione metabolica. Qui, abbiamo confrontato la capacità proliferativa delle cellule endoteliali trattate con controllo o A549 spike CM e l’effetto del trattamento inibitore. A549 spike CM ha diminuito la capacità proliferativa della linea cellulare endoteliale, come mostrato dalla progressiva riduzione della conversione MTT [3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro] (44% su TMNK-1 e 48% sulle cellule EAhy926) il giorno 3 dopo l’esposizione, rispetto al controllo CM. L’uso di tocilizumab e zanubrutinib ha ripristinato la capacità proliferativa delle cellule trattate con CM (Fig. 6C e D).

Le cellule endoteliali senescenti esprimono molecole di adesione per l’attaccamento dei leucociti.
Le molecole di adesione molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1) e la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) sono espressi sulla superficie delle cellule endoteliali in risposta alle citochine, contribuendo all’attaccamento dei leucociti per iniziare la vasculopatia. Abbiamo osservato che le linee di cellule endoteliali TMNK-1 e EAhy926 mostrano una modalità paracrina dello stato di senescenza dopo l’introduzione di CM da cellule epiteliali che esprimono SARS-CoV-2 spike. Abbiamo esaminato se le cellule endoteliali senescenti esprimono molecole di adesione. La nostra analisi Western blot ha mostrato che sia le cellule TMNK-1 che EAhy926 esprimono livelli aumentati di molecole VCAM-1 e ICAM-1 dopo l’esposizione al CM di cellule A549 che esprimono SARS-CoV-2 spike (Fig. 7A e B). Questi livelli aumentati di VCAM-1 e ICAM-1 sono stati ridotti dopo il salvataggio dalla senescenza dopo il trattamento con tocilizumab o zanubrutinib. Per determinare ulteriormente se questi fenotipi contrastanti sono visti in condizioni fisiologiche, abbiamo valutato l’adesione dei leucociti utilizzando un saggio fluorometrico sulla linea cellulare monocitaria umana THP-1. Una significativa adesione cellulare delle cellule THP-1 sulla superficie delle cellule TMNK-1 e EAhy926 è stata rilevata in presenza di CM da cellule A549 che esprimono SARS-CoV-2 spike, in associazione con un’elevata espressione delle molecole di adesione (Fig. 7C e D). La perdita di adesione dei leucociti è confermata anche dalla riduzione di VCAM-1 e ICAM-1 dopo il trattamento con tocilizumab o zanubrutinib. Questi risultati indicano che il traffico di leucociti si verifica verso le cellule endoteliali in un ambiente cellulare in vitro, che è influenzato dall’espressione del picco SARS-CoV-2 e dalla senescenza paracrina nelle cellule epiteliali circostanti.
FIG 7

FIG 7 La senescenza induce l’adesività endoteliale. L’espressione delle molecole di adesione, VCAM-1 e ICAM-1, è stata analizzata mediante Western blot da lisati cellulari TMNK-1 e EAhy926 preparati dopo 24 ore di esposizione di CM da cellule A549 che esprimono spike con o senza trattamento con tocilizumab o zanubrutinib (A e B). Il blot nel pannello A è stato giuntato per rimuovere una corsia in più, indicato dalla linea nera di attrezzaggio. Il livello di espressione di actina in ogni corsia è mostrato come un controllo di carico totale della proteina per il confronto, e lo sfondo del blot è diminuito per la chiarezza dell’immagine. Un’analisi comparativa di leucociti (cellule THP-1 sono stati utilizzati come una linea cellulare modello per i leucociti) adesione sulle cellule endoteliali (TMNK-1 e EAhy926) dopo 24 ore di esposizione di CM in presenza o assenza di tocilizumab o zanubrutinib è mostrato (C e D). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato, e i risultati sono presentati come media ± deviazione standard. **, P < 0.005.

DISCUSSIONE
In precedenza abbiamo riportato una marcata elevazione delle molecole infiammatorie IL-6, IL-1α e HMGB-1 legate alla SASP nel surnatante di coltura delle cellule epiteliali che esprimono la SARS-CoV-2 spike (17). Il presente studio ha rivelato che l’infezione da SARS-CoV-2 o l’espressione della proteina virale spike induce la senescenza delle cellule epiteliali e aumenta i livelli di SA-β-Gal e delle proteine marker p16 e p21. Uno studio recente ha suggerito che le cellule polmonari alveolari di tipo II che ospitano la SARS-CoV-2 mostrano una senescenza con un fenotipo proinfiammatorio, in associazione alla presenza della proteina spike nei pazienti COVID-19 (11). BRD4, una delle proteine della famiglia BET (bromodomain and extraterminal), gioca un ruolo vitale nella senescenza cellulare, compresa la stimolazione della SASP (18). Abbiamo osservato che l’inibizione di BRD4 mediante AZD5153 riduce il rilascio di molecole infiammatorie legate alla SASP e l’espressione di proteine marcatrici associate alla senescenza. Uno studio recente ha anche suggerito che l’inibizione BET blocca la disfunzione cardiaca indotta dall’infiammazione nei pazienti COVID-19 (19).
I ROS sono generati come sottoprodotto del metabolismo cellulare. L’accumulo di ROS causa effetti citostatici a causa della loro capacità di danneggiare il DNA, le proteine e le molecole lipidiche nelle cellule. I ROS causano una varietà di lesioni nel DNA che portano a rotture del doppio filamento del DNA (20). Lo stato di stress ossidativo sistemico è aumentato nei pazienti critici COVID-19 (21). I danni al DNA mediati dallo stress ossidativo accelerano la senescenza cellulare (22). I nostri dati suggeriscono che la presenza della proteina spike della SARS-CoV-2 genera ROS nelle cellule epiteliali. Un trial clinico (registrazione ClinicalTrials n. NCT04377789) sta continuando a valutare l’effetto del farmaco senolitico quercetina per la prevenzione e il trattamento della COVID-19, indicando l’importanza percepita della senescenza nella patogenesi della COVID-19.
L’induzione di molecole infiammatorie è attribuita alla funzione SASP (23). La senescenza cellulare è un induttore di stress nei tessuti, che porta all’espansione della senescenza alle normali cellule bystander attraverso le molecole infiammatorie legate alla SASP (24). Le osservazioni sopra descritte portano ad un ulteriore esame se le cellule epiteliali senescenti possono generare una risposta di senescenza bystander nelle cellule endoteliali vicine. Abbiamo osservato che le cellule endoteliali esposte al CM delle cellule epiteliali che esprimono SARS-CoV-2 spike hanno mostrato segni di senescenza che hanno indotto marcatori di senescenza, comprese le molecole SASP e la generazione di ROS. Il nostro studio precedente ha anche dimostrato che il trattamento delle cellule endoteliali con CM di cellule epiteliali che esprimono spike di SARS-CoV-2 contenenti IL-6 elevata attiva la fosforilazione della tirosina di STAT3, con conseguente induzione dell’espressione di MCP-1; l’aggiunta di tocilizumab inibisce l’espressione di MCP-1 (17). Un recente studio su campioni di fegato post mortem di pazienti COVID-19 ha suggerito il coinvolgimento della segnalazione IL-6 trans nell’endoteliopatia, nell’aumento dell’espressione delle molecole di adesione e nello stravaso leucocitario (25). MCP-1 è una chemochina legata a SASP, e la sua secrezione è stata inibita utilizzando tocilizumab nelle cellule endoteliali. Suggeriamo che la senescenza endoteliale può verificarsi come un effetto spettatore di cellule epiteliali senescenti in modo paracrino dalla segnalazione infiammatoria basata sul recettore. Per verificare, abbiamo incluso il trattamento con zanubrutinib e tocilizumab per bloccare la segnalazione basata sul recettore infiammatorio. L’uso di zanubrutinib ha inibito la fosforilazione di Akt e p38-MAPK, che è importante per innescare il meccanismo di senescenza. I marcatori di senescenza elevati sono stati abbassati dal trattamento di questi inibitori. Quindi, i nostri risultati hanno indicato che le molecole infiammatorie legate al SASP presenti nel CM delle cellule epiteliali che esprimono SARS-CoV-2 spike portano alla senescenza nelle cellule endoteliali e supportano una recente osservazione di un altro gruppo di ricercatori (26). Il blocco della segnalazione mediata dai recettori infiammatori impedisce l’effetto paracrino nelle cellule endoteliali (Fig. 8). L’applicazione di tocilizumab o di inibitori BTK nei casi gravi di COVID-19 può migliorare la strategia di trattamento (27-29).
FIG 8

FIG 8 Presentazione schematica delle cellule epiteliali che esprimono spike virali che portano alla segnalazione a valle per le conseguenze funzionali. La presentazione riflette i potenziali meccanismi dello spike SARS-CoV-2 per promuovere la senescenza endoteliale paracrina che favorisce l’attacco dei leucociti. I potenziali passi inibitori di questi eventi di segnalazione sono mostrati da frecce smussate. sIL-6R, recettore solubile dell’interleuchina-6.

La senescenza endoteliale può portare a complicazioni microvascolari attraverso la secrezione delle molecole di adesione cellulare VCAM-1/ICAM-1, che possono causare l’adesione dei leucociti sulla superficie dell’endotelio e possono aumentare il blocco coronarico (30). L’aumento dell’espressione delle molecole di adesione delle cellule endoteliali è stato notato nei pazienti COVID-19 (31). Il nostro studio ha suggerito che l’uso di tocilizumab e zanubrutinib ha invertito l’effetto di senescenza nelle cellule endoteliali, ha impedito l’espressione di VCAM-1/ICAM-1 e ha ridotto l’attacco dei leucociti.

Una forma non replicabile della proteina spike della SARS-CoV-2 è usata nei vaccini per l’immunizzazione. Pertanto, l’espressione della proteina spike virale e la durata della stimolazione antigenica al sistema immunitario nel tessuto iniettato (anche se prevista per un breve periodo) potrebbero non essere sufficienti per esibire una significativa senescenza o un effetto deleterio sulle cellule endoteliali adiacenti. In questo scenario, gli anziani o le persone anziane che hanno già un accumulo di cellule senescenti possono avere una maggiore possibilità di senescenza paracrina dopo la vaccinazione (32).

I dati epidemiologici di COVID-19 mostrano che il tasso di mortalità dell’infezione da SARS-CoV-2 aumenta con l’età, in particolare negli individui di età avanzata. L’invecchiamento è un declino fisiologico delle funzioni dell’organismo che comporta l’accumulo di cellule che vanno incontro a uno stato di senescenza. Pertanto, la senescenza cellulare potrebbe ipoteticamente contribuire alla patogenesi della COVID-19. Il nostro studio attuale ha rivelato che le cellule epiteliali infettate dalla SARS-CoV-2 subiscono la senescenza, che promuove la segnalazione paracrina per indurre la senescenza in altri tessuti o cellule, portando alla disfunzione endoteliale o alla complicazione microvascolare. L’inversione della senescenza dimostrata in questo studio può essere estesa ad applicazioni cliniche per alleviare la gravità della malattia e agire come una potenziale terapia aggiuntiva per ridurre la mortalità COVID-19.

Scelto da Alessia C. F. (ALKA) https://journals.asm.org/doi/10.1128/JVI.00794-21

MATERIALI E METODI
Coltura cellulare e trasfezione transitoria.
Cellule epiteliali polmonari umane trasformate (A549), cellule epiteliali epatiche (Huh7.5), cellule endoteliali sinusoidali del fegato (TMNK-1) (gentilmente fornite da A. Soto-Gutierrez, Università di Pittsburg, Pittsburg, PA), e le cellule EAhy926 sono state coltivate in mezzo Dulbecco modificato Eagle (DMEM; HyClone) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS; Sigma), 100 U di penicillina / ml, e 100 μg di streptomicina / ml (Sigma). Le cellule sono state mantenute in un’atmosfera umidificata a 37°C con 5% di CO2.
Le cellule sono state subcoltivate in una piastra a 6 pozzetti fino al ∼60% di confluenza durante la notte e trasfettate con DNA plasmidico (pcDNA3.1-SARS-Cov-2-Spike MC-0101087-5834, gentilmente fornito da BEI Resources) o con un costrutto vettoriale vuoto (2.5 μg/well) usando Lipofectamine 3000 (Life Technologies) seguendo le istruzioni del produttore. Lisati cellulari sono stati preparati per le analisi dopo 72 ore di trasfezione. Il surnatante della cultura è stato raccolto dopo 72 ore (A549 spike CM), con o senza 16 ore di incubazione con l’inibitore.
Per l’infezione con SARS-CoV-2, le cellule A549 sono state mantenute in DMEM contenente 2% FBS prima della raccolta. Un isolato SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020, BEI Resources) derivato da un isolato proveniente da Wuhan, Cina, è stato usato per infettare le cellule ad una molteplicità di infezione di 0,5. Tutti gli esperimenti con virus vivi sono stati eseguiti in un impianto P3 approvato dal Comitato Istituzionale di Biosicurezza. Lisati cellulari sono stati raccolti 48 ore dopo l’infezione.
Senescenza-associato espressione β-galattosidasi.
Le cellule sono state esaminate utilizzando il kit di rilevamento della senescenza cellulare SPiDER-β-Gal (Dojindo). Le cellule A549 trasfezionate con Spike sono state misurate per l’espressione SA-β-Gal a 72 ore dopo la trasfezione. Le cellule TMNK-1 sono state misurate a 24 ore dopo l’esposizione al terreno di coltura A549 condizionata da spike (CM). Le cellule sono state inizialmente esposte a bafilomicina A1 per 1 h per inibire l’attività endogena β-Gal. Le cellule sono state trattate con SPiDER-β-Gal reagente e incubato per un ulteriore 30 min prima della visualizzazione a ×40 ingrandimento al microscopio a immunofluorescenza seguendo il protocollo del fornitore.
Analisi Western blot. I lisati cellulari sono stati elettroforesi per risolvere le proteine tramite SDS-PAGE, trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e bloccati con latte secco non grasso al 4%. La membrana è stata incubata a 4°C durante la notte con un anticorpo primario specifico, seguito da un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano. La macchia della stessa corsa è stata riprofilata con l’anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) β-actina (Sigma) per confrontare la carica proteica in ogni corsia. Sono stati utilizzati anticorpi disponibili in commercio per fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182), fosfo-Akt (S473), p21, γ-H2AX (Cell Signaling), VCAM-1, ICAM-1 e p16 (Santa Cruz Biotechnologies). I Western blot sono stati sviluppati con il kit di chemiluminescenza SuperSignal West Pico (Thermo Scientific) utilizzando il protocollo del produttore. I risultati della scansione densitometrica sono esposti come media di tre esperimenti separati.
Immunofluorescenza.
Le cellule A549 sono state trasfettate con Lipofectamine 3000 con la proteina spike SARS-CoV-2 usando un costrutto di collegamento con la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP). Dopo 48 ore, le cellule sono state fissate e l’anticorpo γ-H2AX (Cell Signaling) è stato usato per l’immunofluorescenza (IF). γ-H2AX è stato visualizzato utilizzando anti-rabbit Alexa Fluor 594 (Invitrogen). I nuclei sono stati colorati con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). La fluorescenza è stata visualizzata a ×40 ingrandimento con un microscopio a immunofluorescenza (Leica).
Trattamento dell’inibitore.
Le cellule sono state incubate in presenza di tocilizumab (5 mg/ml; Absolute Antibody) per 24 h (33), AZD5153 (500 ng/ml; Cayman Chemical) per 24 h (34), o zanubrutinib (500 ng/ml; SelleckChem) per 24 h (35). AZD5153 e zanubrutinib sono stati dissolti in DMSO.
ELISA. Il mezzo di coltura cellulare (CM) delle cellule SARS-CoV-2 spike-trasfettate è stato analizzato per la presenza di IL-6, MCP-1, IL-1α (Sigma), e HMGB-1 (Novus Biologicals) secreti utilizzando kit ELISA (enzyme-limited immunosorbent assay) seguendo le istruzioni del produttore. Sono stati utilizzati anche il terreno di coltura delle cellule TMNK-1 esposte al CM delle punte A549 e il CM delle cellule A549 che esprimono punte in presenza o in assenza di inibitori.
Saggio ROS. Le cellule A549 sono state coltivate dopo la trasfezione della proteina spike SARS-CoV-2 per 48 ore e sono state trattate con inibitori per 24 ore in un incubatore a 37°C CO2. Le cellule TMNK-1 sono state esposte alla CM A549 spike e incubate come descritto sopra 24 ore prima della misurazione. I ROS intracellulari sono stati misurati usando un kit di rilevamento ROS disponibile in commercio basato su test cellulari (Cayman Chemicals).
Test di adesione dei leucociti.
L’attaccamento dei leucociti sulla superficie delle cellule endoteliali è stato eseguito utilizzando cellule derivate da monociti (THP-1) con TMNK-1 e cellule endoteliali EAhy926. L’adesione delle cellule THP-1 è stata misurata utilizzando il kit di adesione CytoSelect leucocyte-endothelium (Cell Biolabs, Inc.) seguendo il protocollo del fornitore.
Analisi statistica. Graph Pad Prism 7 è stato utilizzato per analizzare i dati sperimentali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre volte per la riproducibilità. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard. Le analisi t test a due code sono state eseguite per confrontare i valori medi tra i due gruppi. Un valore P di <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
RICONOSCIMENTI
Ringraziamo Daniel Hoft da Malattie Infettive, James Brien da Microbiologia Molecolare & Immunologia, e Ratna B. Ray di Patologia per i suggerimenti sul nostro studio.
Lo studio è stato supportato da un finanziamento di sovvenzione da parte della Saint Louis University.
I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, la raccolta e l’analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o la preparazione del manoscritto.
Dichiariamo di non avere conflitti di interesse.
T. Patra e R. Ray hanno progettato gli esperimenti. K. Meyer, T. Patra e Vijayamahantesh hanno condotto gli esperimenti. R. Ray ha analizzato i risultati. Tutti gli autori hanno redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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Alessia C. F. (ALKA)
Esploro, indago, analizzo, cerco, sempre con passione. Sono autonoma, sono un ronin per libera vocazione perché non voglio avere padroni. Cosa dicono di me? Che sono filo-russa, che sono filo-cinese. Nulla di più sbagliato. Io non mi faccio influenzare. Profilo e riporto cosa accade nel mondo geopolitico. Freiheit ist ein Krieg. Preferisco i piani ortogonali inclinati, mi piace nuotare e analizzare il mondo deep. Ascolto il rumore di fondo del mondo per capire quali nuove direzioni prende la geopolitica, la politica e l'economia. Mi appartengo, odio le etichette perché come mi è stato insegnato tempo fa “ogni etichetta è una gabbia, più etichette sono più gabbie. Ma queste gabbie non solo imprigionano chi le riceve, ma anche chi le mette, in particolare se non sa esattamente distinguere tra l'etichetta e il contenuto. L'etichetta può descrivere il contenuto o ingannare il lettore”. So ascoltare, seguo il mio fiuto e rifletto allo sfinimento finché non vedo tutti gli scenari che si aprono sui vari piani. Non medito in cima alla montagna, mi immergo nella follia degli abissi oscuri dell'umanità.